滅菌操作開始前，需完成設備預處理與耗材準備工作，避免因準備不足導致滅菌不或設備損壞。首先應將培育箱內所有培養皿、支架、托盤等可拆卸部件取出，用 75% 醫用酒精棉球逐一擦拭表面，去除可見污漬與殘留細胞，隨后置于生物安全柜內紫外線照射 30 分鐘備用。對于培育箱內部，需先關閉二氧化碳進氣閥門與電源，待箱內溫度降至室溫后，用無菌紗布蘸取中性洗滌劑輕輕擦拭內壁，清除冷凝水與附著的有機物雜質，特別注意溫度傳感器、濕度傳感器及二氧化碳探頭等精密部件，避免用力摩擦造成損壞。耗材方面需提前準備足量 75% 醫用酒精、無菌蒸餾水、專用滅菌劑（如過氧乙酸溶液）、一次性手套、防護口罩及無菌抹布，確保整個操作過程符合無菌操作規范。

目前主流的二氧化碳培育箱滅菌方法主要包括高溫干熱滅菌、過氧化氫低溫等離子滅菌與化學試劑擦拭滅菌，不同方法適用于不同設備類型與滅菌需求，需根據實際情況選擇。高溫干熱滅菌適用于具備高溫滅菌功能的培育箱，操作時先將箱內可拆卸部件重新安裝到位，關閉箱門并確認密封良好，通過設備控制面板設置滅菌溫度為 180℃，滅菌時間為 2 - 3 小時，同時關閉濕度控制系統與二氧化碳供給系統。滅菌過程中需實時監控設備運行狀態，避免溫度異常波動，滅菌結束后待箱內溫度自然降至 60℃以下，再打開箱門通風 30 分鐘，隨后用無菌蒸餾水擦拭內壁，調節濕度至適宜范圍（通常為 95% 左右），通入二氧化碳至設定濃度（一般為 5%），靜置 24 小時后即可投入使用。

過氧化氫低溫等離子滅菌適用于對高溫敏感的培育箱，尤其適合含電子元件較多的設備。操作前需將培育箱內所有部件清潔并干燥，將濃度為 30% 的過氧化氫溶液注入專用滅菌裝置，關閉箱門并啟動滅菌程序。滅菌過程分為抽真空、過氧化氫霧化、等離子體激發、通風排氣四個階段，總時長約為 2 - 3 小時。該方法通過過氧化氫分解產生的羥基自由基與等離子體共同作用，實現對微生物的高效殺滅，且滅菌后無殘留，無需額外通風處理。滅菌完成后需通過生物指示劑（如嗜熱脂肪桿菌芽孢）驗證滅菌效果，確認合格后即可正常使用。

化學試劑擦拭滅菌作為日常維護的補充方法，適用于短期使用且污染風險較低的情況。操作時需佩戴無菌手套與防護口罩，用無菌紗布蘸取 75% 醫用酒精或 0.5% 過氧乙酸溶液，對培育箱內壁、支架、托盤等表面進行均勻擦拭，尤其注意角落、縫隙等易滋生微生物的部位。擦拭完成后打開箱門通風 30 分鐘，待試劑揮發后關閉箱門，調節至正常培養條件，靜置 12 小時后使用。需注意該方法僅能實現表面消毒，無法殺滅隱藏在設備內部管道或傳感器中的微生物，因此不能替代的滅菌操作。